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基因分型技術(shù)新突破：Allegro靶向基因分型技術(shù)詳解

基因分型（Genotyping）是利用分子生物學(xué)方法檢測生物個體基因型的技術(shù)，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，具有廣泛的應(yīng)用價值：在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，常用于進行形狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等等；醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用于分析診斷疾病導(dǎo)致的遺傳變異，分子遺傳機制、易感性位點篩選及藥物敏感位點篩選等。

目前常用的基因分型手段主要是基于NGS的簡化基因組方法，包括GBS、RAD、ddRAD等，這些簡化基因組方法都能夠提供開放、無偏差的基因分型，但卻沒有一種技術(shù)可以實現(xiàn)針對靶向基因區(qū)的高效分型——單基因、基因家族、啟動子和增強子、基因簇及非編碼基因等都可能含有重要的與表型變異密切相關(guān)的多態(tài)性。因為傳統(tǒng)的簡化基因組技術(shù)，由于其以隨機的方式研究遺傳變異，獲取的信息大部分在這些區(qū)域之外，就導(dǎo)致了有價值標(biāo)記的檢測缺失。雖然經(jīng)典的微陣列的方法可以規(guī)避這一缺漏，但卻存在著當(dāng)基因池改變時會出現(xiàn)較強的檢測偏差和較差的可重復(fù)性問題。

讓我們來了解一種兩全其美的新方法：

Allegro靶向基因分型，提供了一種快速、可擴展、高效經(jīng)濟的單引物富集技術(shù)（SPET），基于新一代測序技術(shù)對各類生物樣本的特異性靶向區(qū)域SNP進行有針對性的測序分型。該方法可以通過捕獲每個靶向測序序列的SNP特異性數(shù)據(jù)點，提供豐富有效的測序數(shù)據(jù)，不僅有效獲得靶向區(qū)分型結(jié)果，更可以快速構(gòu)建具有可擴展性及低成本單SNP位點檢測流程。

技術(shù)流程如下：

1. 將基因組酶切打斷，該步驟操作便捷，可實現(xiàn)自動化；

2. 將片段化的基因組接上indexed adaptor ，DimerFree技術(shù)可消除接頭二聚體的形成;

3. 針對靶向區(qū)域設(shè)計的探針捕獲目標(biāo)區(qū)域捕獲；

4. 擴增后獲得靶向區(qū)域序列文庫，測序后得到分型結(jié)果。

Allegro靶向基因分型通過探針設(shè)計及“雞尾酒”式的酶切組合進行基因組片段化，能夠有效地將SNP控制在測序讀長范圍內(nèi)，輔以優(yōu)化過的探針設(shè)計，確保SNP可通過單端測序測序模式檢出。退火位點的設(shè)計也規(guī)避了已知多態(tài)性位點的位置，以確保擴增過程不會因此而造成偏倚。如果選擇雙端測序測序，還可在read 2中獲得新的未知多態(tài)性位點信息，充實研究結(jié)果（下圖）。

Allegro靶向基因分型的優(yōu)勢如下：

• 方便在自動化工作站上建庫
• 設(shè)計靈活
• 可擴展復(fù)用
• 檢測準(zhǔn)確
• 集成了酶促打斷
• 低起始量（10 – 1100 ng）
• 高檢測通量（100 – >100,000 SNPs）
• 建庫周期短（<24 h）

截至目前，已有包括人，動物，植物在內(nèi)的多個物種開展了基于SPET技術(shù)的基因分型。

今天跟大家分享的是該技術(shù)在黑楊及玉米的研究中的應(yīng)用實例：

為了評估SPET技術(shù)的分型效果及技術(shù)性能，研究對10個玉米株系（5個近交系 F7, H99, HP301, Mo17, W153R; 5個雜交F1：A632XB73, B73XF7, W153RXHP301, B73XB96, B73XMo17）同時開展了基于illumina MaizeSNP50芯片分型的研究和SPET分型，并對540株黑楊構(gòu)成的自然群體進行SPET分型及Panel分型研究，以獲得與生物量表型相關(guān)的位點信息。

玉米研究中發(fā)現(xiàn)，全部樣本中目標(biāo)位點的覆蓋度十分相似（約50×，下圖A），通過提高覆蓋度閾值，檢測的準(zhǔn)確性有改善，在50×到達的平臺期后，準(zhǔn)確率可達97.2%（下圖B）。分析結(jié)果比較顯示，無論在準(zhǔn)確度和可重復(fù)性方面，自交系個體都比雜交系個體呈現(xiàn)更好的結(jié)果（下圖C、D）

針對黑楊的大規(guī)模基因分型研究中，采用SPET技術(shù)，靶向?qū)崿F(xiàn)了目標(biāo)區(qū)域的捕獲分型，共捕獲靶向位點數(shù)66922個，并且在非靶向區(qū)域內(nèi)獲得了453170個非靶向多態(tài)性位點。等位基因頻率研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)區(qū)域位點等位基因頻率在一定程度上與應(yīng)用的選擇標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)（下圖），de novo方法側(cè)重*或極低的等位基因頻率。

對不同方法獲得的SNP分型結(jié)果進行樣本間聚類，發(fā)現(xiàn)de novo方法可增強樣本群體間聚類的性能，更好的體現(xiàn)出差異性類群。（下圖）

綜上，Allegro靶向基因分型的SPET技術(shù)一次性突破了舊基因分型技術(shù)的瓶頸，將靶向捕獲研究與可拓展性的簡化基因組相結(jié)合，是一種可靠高效低成本的基因分型技術(shù)流程。在實現(xiàn)了可拓展研究的同時，縮減了實驗耗時。這些優(yōu)勢彌補了此前微陣列技術(shù)和簡化基因組技術(shù)的不足，為大規(guī)模群體的穩(wěn)定靶向基因分型提供了具有高性價比的技術(shù)手段。

主要參考文獻：

Single primer enrichment technology as a tool for massive genotyping: a benchmark on black poplar and maize. ANNALS OF BOTANT, 2019.